從混雜微生物群體中獲得只含有某一種微生物的過程稱為微生物分離與純化。
1. 利用固體培養基分離
微生物在固體培養基上生長形成的單個菌落，通常是由一個細胞繁殖而成的集合體，因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養。在平板上的單個菌落并不一定保證是純培養，因此，純培養的確定除觀察其菌落特征外，還要結合顯微鏡檢測個體形態特征后才能確定。有些微生物的純培養要經過一系列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。
（1）稀釋傾注平板法
先將待分離的材料用無菌水作一系列的稀釋（如 1 ∶ 10 、 1 ∶ 100 、 1 ∶ 1000 …），然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至 45 ℃左右的瓊脂培養基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養一定時間即可看出菌落。如果稀釋得當，在平板表面或瓊脂培養基中就可出現分散的單個菌落，這個菌落可能就是由一個**細胞繁殖形成的。隨后挑取該單個菌落，或重復以上操作數次，便可得到純培養。
（2）涂布平板法
將含菌的樣品加入還比較燙的瓊脂培養基，再倒平板，易造成某些熱敏感菌的死亡，某些好氧菌會在瓊脂中間缺氧影響生長。
2. 用液體培養基分離純培養
連續稀釋，使一只試管里分配不到一個微生物。如果大多數平行稀釋管里沒有微生物生長，那么有微生物生長的試管得到的培養物就是純培養物。
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