小RNA作用與應(yīng)用研究繼2001，2002連續(xù)兩年被美國Science雜志評為年度10大突破技術(shù)以來，近年來繼續(xù)熱度高漲，名列前矛。其核心技術(shù)RNA干擾(RNAi)，即用20多個核苷酸組成的短的雙鏈RNA(siRNA)代替?zhèn)鹘y(tǒng)反義核酸進行轉(zhuǎn)錄后基因沉默，已經(jīng)迅速而廣泛地應(yīng)用到基因功能，基因表達調(diào)控機制研究等熱門領(lǐng)域，不僅如此，它還為基因**開辟了新的途徑。此外，RNAi沉默機制的探索也取得了相當?shù)倪M展。目前，在大致勾畫出生物體內(nèi)源性小RNA的重要作用框架后，進一步闡述其作用細節(jié)、探索小RNA對細胞行為的調(diào)控、如何利用RNAi進行**防治等等都成為生物學(xué)家研究的一大熱點。
1、RNAi的作用機制
通過生化和遺傳學(xué)研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段(inititationandeffectorsteps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(smallinterferingRNAs，siRNAs)。證據(jù)表明;一個稱為Dicer的酶，是RNaseIII家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3’端都有2個堿基突出。在RNAi效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了，但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。另外，還有研究證明含有啟動子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23nt長的片段，這種dsRNA可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA序列甲基化，從而使啟動子失去功能，使其下游基因沉默。其基本原理見(圖1)：
2.1.2、RNAi目標序列的選取原則
RNAi目標序列的選取原則應(yīng)遵循以下幾個方面的原則：(1)從轉(zhuǎn)錄本(mRNA)的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結(jié)果顯示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設(shè)計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區(qū)(untranslatedregions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。(2)將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(人，或者小鼠，大鼠等等)進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)(3)選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設(shè)計多個靶序列的siRNA，以找到有效的siRNA序列。
2.1.3、陰性對照
一個完整的siRNA實驗應(yīng)該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和目的靶細胞中其他基因沒有同源性。
2.2、siRNA的制備
目前為止較為常用的方法有通過化學(xué)合成，體外轉(zhuǎn)錄，長片斷dsRNAs經(jīng)RNaseIII類降解(e.g.Dicer，E.coli，RNaseIII)體外制備siRNA，以及通過siRNA表達載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達產(chǎn)生siRNA。
2.2.1、體外制備
2.2.1.1、化學(xué)合成
當前，許多國外公司都可以根據(jù)用戶要求高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3—4對siRNAs的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出有效的序列再進行化學(xué)合成。
適用于：已經(jīng)找到有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素
2.2.1.2、體外轉(zhuǎn)錄
以DNAOligo為模版，通過體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs，成本相對化學(xué)合成法而言比較低，而且能夠比化學(xué)合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實驗的規(guī)模受到限制，雖然一次
體外轉(zhuǎn)錄合成能足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學(xué)合成相比，還是需要占用研究人員相當?shù)臅r間。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，只需要化學(xué)合成的siRNA量的1/10就可以達到化學(xué)合成siRNA所能達到的效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高。適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學(xué)合成的價格成為障礙時。不適用于：實驗需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。
2.2.1.3、用RNaseIII消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA
其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法——制備一份混合有各種siRNAs“混合雞尾酒”就可以避免這個缺陷。選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA，然后用RNaseIII(orDicer)在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細胞，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。dsRNA消化法的主要優(yōu)點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時間和**(注意：通常用RNAseIII通常比用Dicer要便宜)。不過這種方法的缺點也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因。現(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常不會造成影響。適用于：快速而經(jīng)濟地研究某個基因功能缺失的表型不適用于：長時間的研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進行研究，特別是基因**
2.2.2、體內(nèi)表達
前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs轉(zhuǎn)到細胞內(nèi)。而采用siRNA表達載體和基于PCR的表達框架則屬于：從轉(zhuǎn)染到細胞的DNA模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNAs。這兩種方法的優(yōu)點在于不需要直接操作RNA。
2.2.2.1、siRNA表達載體
多數(shù)的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III啟動子(polIII)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA，shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNApolIII啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串(3到6個)U來終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的polIII啟動子下游。由于涉及到克隆，這個過程需要幾周甚至數(shù)月的時間，同時也需要經(jīng)過測序以保證克隆的序列是正確的。siRNA表達載體的優(yōu)點在于可以進行較長期研究——帶有***標記的載體可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因的表達，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。病毒載體也可用于siRNA表達，其優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的種種不便，而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定。適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默。不適用于：篩選siRNA序列(其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作)。
2.2.2.2、siRNA表達框架
siRNA表達框架(siRNAexpressioncassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達模版，包括一個RNApolIII啟動子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個RNApolIII終止位點，能夠直接導(dǎo)入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。和siRNA表達載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由PCR得到，不用**的時間。因此，SECs成為篩選siRNA的有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點，那么通過SECs篩選出的有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構(gòu)建siRNA表達載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達siRNA和長效抑制的研究。這個方法的主要缺點是①PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細胞中(晶賽公司的Protocal可以解決這一問題)②不能進行序列測定，PCR和DNA合成時可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)果不理想。適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選佳啟動子不適用于：長期抑制研究。(如果克隆到載體后就可以了)
2.3、siRNA的轉(zhuǎn)染
將制備好的siRNA，siRNA表達載體或表達框架轉(zhuǎn)導(dǎo)至真核細胞中的方法主要有以下幾種：
2.3.1、磷酸鈣共沉淀
將氯化鈣，RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質(zhì)。沉淀物的大小和質(zhì)量對于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準，保證質(zhì)量，因為甚至偏離優(yōu)條件十分之一個pH都會導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。
2.3.2、電穿孔法
電穿孔通過將細胞暴露在短暫的高場強電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。將細胞懸浮液置于電場中會誘導(dǎo)沿細胞膜的電壓差異，據(jù)認為這種電壓差異會導(dǎo)致細胞膜暫時穿孔。電脈沖和場強的優(yōu)化對于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞膜而裂解細胞。一般，成功的電穿孔過程都伴隨高水平(50%或更高)的毒性。2.3.3、DEAE-葡聚糖和polybrene帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復(fù)合物和帶負電的DNA分子使得DNA可以結(jié)合在細胞表面。通過使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復(fù)合體導(dǎo)入。兩種試劑都已成功用于轉(zhuǎn)染。DEAE-葡聚糖**于瞬時轉(zhuǎn)染。
2.3.4、機械法
轉(zhuǎn)染技術(shù)也包括使用機械的方法，比如顯微注射和基因槍(biolisticparticle)。顯微注射使用一根細針頭將DNA，RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細胞質(zhì)或細胞核。基因槍使用高壓microprojectile將大分子導(dǎo)入細胞。
2.3.5、陽離子脂質(zhì)體試劑
在優(yōu)化條件下將陽離子脂質(zhì)體試劑加入水中時，其可以形成微小的(平均大小約100-400nm)單層脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結(jié)合到DNA的磷酸骨架上以及帶負電的細胞膜表面。因此使用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與以前利用中性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理不同。使用陽離子脂質(zhì)體試劑，DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負電的DNA自動結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物。據(jù)稱，一個約5kb的質(zhì)粒會結(jié)合2-4個脂質(zhì)體。被俘獲的DNA就會被導(dǎo)入培養(yǎng)的細胞。現(xiàn)存對DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)原理的證據(jù)來源于內(nèi)吞體和溶酶體。
2.4、siRNA的高轉(zhuǎn)染效率需注意的幾點事為了達到高的轉(zhuǎn)染效率，在轉(zhuǎn)染實驗過程中，需要注意以下幾點：
1.純化siRNA在轉(zhuǎn)染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學(xué)合成的RNA通常需要跑膠電泳純化(即PAGE膠純化)。
2.避免RNA酶污染微量的RNA酶將導(dǎo)致siRNA實驗失敗。由于實驗環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。
3.健康的細胞培養(yǎng)物和嚴格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性通常，健康的細胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實驗所用細胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實驗，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細胞，否則細胞轉(zhuǎn)染效率會隨時間明顯下降。
4.避免使用***Ambion公司推薦從細胞種植到轉(zhuǎn)染后72小時期間避免使用***。***會在穿透的細胞中積累**。有些細胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做對比實驗，以得到佳轉(zhuǎn)染效果。
5.選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑針對siRNA制備方法以及靶細胞類型的不同，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對siRNA實驗的成功至關(guān)重要。
6.通過合適的陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件對大多數(shù)細胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細胞(同樣適合實驗靶siRNA)，轉(zhuǎn)染48小時后統(tǒng)計對照蛋白或mRNA相對于未轉(zhuǎn)染細胞的降低水平。過多的siRNA將導(dǎo)致細胞毒性以至死亡。7.通過標記siRNA來優(yōu)化實驗熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內(nèi)定位及雙標記實驗(配合標記抗體)來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導(dǎo)入了siRNA的細胞。
3、制備siRNAs或者dsRNA試劑盒的選取
長片斷的dsRNA可以在植物、原生動物、昆蟲、線蟲中引發(fā)基因沉默。要研究這些對象，自己制備長片斷的dsRNA是很容易做到的：通過合適的質(zhì)粒亞克隆——線性化——體外轉(zhuǎn)錄的方法，就可以自己合成dsRNA。目前已經(jīng)有商品化合成dsRNA的試劑盒(例如NEB的HiScribeRNAiTranscriptionKit，后文介紹)。但是在哺乳動物細胞中，超過30nt的dsRNAs則引起非特異基因沉默。實驗表明，在哺乳動物細胞內(nèi)引發(fā)特異的基因沉默有效的siRNAs是有19個堿基互補，兩邊3'端各有2個堿基突出(通常是UU，但是目前不清楚UU對siRNAs的活性影響有多大)的一對21-mer的dsRNAs。由于體外轉(zhuǎn)錄利用T7RNA聚合酶進行體外擴增的時候，通常要求序列的首2個堿基為GG或者GA以提高合成效率，但是這兩個額外的堿基會大大降低siRNAs的活性，而且通常體外轉(zhuǎn)錄很難高效合成這么小的RNA(通常需在25nt以上)，因而早先哺乳動物細胞的RNAi實驗中用到的siRNAs是用化學(xué)方法合成的，方便，簡潔，不受堿基的限制。可是不管怎么說，化學(xué)合成RNA的費用是相當高的(一個堿基要將近400元)，特別是在哺乳動物細胞中siRNAs的效率不一，一般一個基因需要設(shè)計3—5對siRNAs以確定有效的，這樣的費用就高了(就是6—10條siRNAs(每條21nt)，一個基因通常花費不少于20000)。如果需要重復(fù)設(shè)計，在還有時間上的困擾。現(xiàn)在，多個廠家推出了不同的試劑盒，一個試劑盒可以自行設(shè)計合成多個siRNAs，靈活性和可控性都明顯提高，不失為一種經(jīng)濟的選擇。例如在體外轉(zhuǎn)錄制備siRNA時，Silencer™siRNAConstructionKit——LowerCost&HigherPotencysiRNAsAmbion公司的這個試劑盒是建立在體外轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)上的，其的設(shè)計有效克服了前面提到的難題，原理非常簡單：首先合成兩段29-mer的DNA作為模版(DNA合成的價格就便宜多了，即使是全球的DNA合成供應(yīng)商Operon，也就是7、8塊錢一個堿基)，包括8個與T7啟動子引物3'端匹配的堿基(稱為引導(dǎo)序列，leadersequence)和21個設(shè)計的siRNA序列。將這兩個模版和對應(yīng)的T7啟動子引物分別混合，引物末端和DNA模版褪火結(jié)合，用DNA聚合酶Klenow大片斷補平成為雙鏈DNA模版，分別用T7RNA聚合酶進行體外轉(zhuǎn)錄，將產(chǎn)物混合形成dsRNA，新的雙鏈RNA包含5'端單鏈的引導(dǎo)序列和中間互補的19個堿基序列以及3'端兩個重復(fù)的U(UU)。通過DNA酶降解模版，同時用單鏈專一的核酸酶消化5'的引導(dǎo)序列，由于RNase不能切開U堿基也不能切雙鏈RNA，所以得到的產(chǎn)物就是我們需要的21-mer的雙鏈siRNAs——有19個堿基互補，3'端各有2個U突出。通過試劑盒的純化小柱，去除引物、堿基鹽和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，得到的就是可以立即轉(zhuǎn)化用的siRNAs！
4、RNAi存在的若干問題及其前景展望
目前RNAi機制尚未完全闡明，尤其在哺乳動物細胞中的研究報道不多。siRNA在哺乳動物細胞中抑制mRNA表達是有效的，但并不能象果蠅細胞那樣完全抑制目的基因的表達，可能是因為生物體是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，存在多種機制相互作用以調(diào)控基因的表達。另外，在哺乳動物中，RNAi能否成功地抑制基因表達以及抑制的程度還取決于細胞類型。對線蟲來說，可以采用注射、浸泡或喂食的方法轉(zhuǎn)入dsRNA，而對哺乳動物來說，尋找高效的方式來轉(zhuǎn)入siRNA以及快速的方式來篩選RNAi尚需進一步探索。RNAi在抗病毒感染中的應(yīng)用令人振奮，但能否成功還無法保證。在研究中亦有諸多困難：(1)并不是所有的病毒RNA序列都能比較容易的接近siRNA，被識別、切割。有些病毒靶序列可能隱藏在二級結(jié)構(gòu)下，或者位于高度折疊的區(qū)域中，而有些病毒序列可能與蛋白質(zhì)形成緊密的復(fù)合物，阻礙了與siRNA的識別。(2)病毒的復(fù)制過程并不嚴格，隨意性很強，因此往往產(chǎn)生突變的子代。這一特點能夠幫助病毒躲避機體的**監(jiān)控和**的抑制作用，同時也會干擾siRNA的識別。(3)在siRNA的導(dǎo)入問題上，同樣也面臨著技術(shù)上的困難。(4)因為細胞內(nèi)的RNA酶會降解siRNA，故怎樣保證siRNA的穩(wěn)定性仍是一個亟需解決的問題。盡管目前對RNAi的研究還不夠深入，RNAi還不夠完善，但這種現(xiàn)象在自然界是普遍存在且有效的，其應(yīng)用前景十分廣闊。它不僅能大大推動人類后基因組計劃(蛋白組學(xué))的發(fā)展，還有可能設(shè)計出RNAi芯片，高通量地篩選**靶基因，逐條檢測人類基因組的表達抑制情況來明確基因的功能，并且它還將應(yīng)用于基因**、新藥開發(fā)、生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域，用RNAi技術(shù)來抑制基因的異常表達，為**癌癥、遺傳病等**開辟了新的途徑。從發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象至今，只有短短的幾年時間，但由于它的重要作用，使其成為生命科學(xué)中的研究熱點。今后的研究應(yīng)主要集中于RNAi作用的機制及如何進一步完善RNAi技術(shù)。
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